Bewerkt door Peter Sarnow, Stanford University School of Medicine, Stanford University, Californië, goedgekeurd op 25 december 2020 (beoordeeld op 25 oktober 2020)
We rapporteren de interactie tussen subeenheden bij de replicatie van coronavirussen-transcriptiecomplexen, die essentieel zijn voor replicatie en evolutionair behoud.We hebben bewijs geleverd dat het NiRAN-domein geassocieerd met nsp12 nucleosidemonofosfaat (NMP) transferase-activiteit heeft in trans, en nsp9 (een RNA-bindend eiwit) als doelwit hebben geïdentificeerd.NiRAN katalyseert de covalente hechting van het NMP-gedeelte aan het geconserveerde nsp9-amino-uiteinde in een reactie die afhankelijk is van Mn2+-ionen en aangrenzende geconserveerde Asn-residuen.Er werd vastgesteld dat NiRAN-activiteit en nsp9 NMPylatie essentieel zijn voor de replicatie van het coronavirus.De gegevens stellen ons in staat deze activiteit van de geneste virusenzymmarker te koppelen aan de eerdere waarnemingen in de hypothese dat de initiatie van RNA-synthese in een klasse van RNA-virussen functioneel en evolutionair consistent is.
Het RNA-afhankelijke RNA-polymerase (RdRps) van Nidovirales (Coronaviridae, Arterioviridae en 12 andere families) is gekoppeld aan het amino-terminale (N-terminale) domein in het niet-structurele eiwit (nsp) dat vrijkomt uit het polyproteïne, NiRAN genaamd. 1ab is samengesteld uit viraal hoofdprotease (Mpro).Eerder werd de eigen GMPylatie/UMPylatie-activiteit van het arteriële virus NiRAN-RdRp nsp gerapporteerd, en er werd gesuggereerd om een transiënt te genereren voor de overdracht van nucleosidemonofosfaat (NMP) naar het (momenteel onbekende) virus en/of celbiopolymerisatie-dingen.Hier laten we zien dat het coronavirus (Human Coronavirus [HCoV]-229E en Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2) nsp12 (NiRAN-RdRp) Mn2+-afhankelijke NMPylatie-activiteit heeft, die is afgeleid van nsp9 door de vorming van Mpro-gemedieerde nsp9. de N-terminale flankerende nsps wordt proteolytisch vrijgegeven, het fosforamidaat wordt gebonden aan het primaire amine (N3825) aan de N-terminal van nsp9.Uridinetrifosfaat is het voorkeursnucleotide bij deze reactie, maar adenosinetrifosfaat, guanosinetrifosfaat en cytidinetrifosfaat zijn ook geschikte co-substraten.Mutatiestudies met behulp van recombinante coronavirus nsp9- en nsp12-eiwitten en genetisch gemanipuleerde HCoV-229E-mutanten bepaalden de residuen die nodig zijn voor NiRAN-gemedieerde nsp9-NMPylatie en virusreplicatie in celcultuur.De gegevens bevestigden de voorspelling van NiRAN-residuen op de actieve plaats en bepaalden de belangrijke rol van nsp9 N3826-residuen bij nsp9-NMPylatie en virusreplicatie in vitro.Dit residu maakt deel uit van de geconserveerde N-terminale NNE-tripeptidesequentie en bleek het enige invariante residu van nsp9 en zijn homologen in de coronavirusfamilie te zijn.Deze studie biedt een solide basis voor de functionele studie van NMPyleringsactiviteit van andere geneste virussen en stelt mogelijke doelen voor de ontwikkeling van antivirale geneesmiddelen voor.
Het positiefstrengige RNA-virus van Nidovirales infecteert een verscheidenheid aan gewervelde en ongewervelde dieren (1, 2).De bestelling omvat momenteel 14 families (3), waarvan de Coronavirus-familie de afgelopen 20 jaar uitgebreid is bestudeerd.Destijds kwamen drie zoönotische coronavirussen voort uit dierlijke gastheren en veroorzaakten grootschalige uitbraken van ernstige luchtweginfecties bij mensen.Inclusief aanhoudende pandemieën veroorzaakt door ernstige acute infectieziekten.Ademhalingssyndroom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) (4âââ7).Nidovirussen delen een gemeenschappelijke genoomorganisatie, en de subeenheid van het membraangebonden replicatie-transcriptiecomplex (RTC) is gecodeerd in het 5-μ-terminale tweederde en de belangrijkste structurele subeenheid van het virusdeeltje, evenals enkele accessoires .Eiwit, gecodeerd in het 3??² uiteinde van het genoom (1).Met uitzondering van één familie van planaire virussen (Monoviridae) (8), coderen alle geneste virussen voor RTC-subeenheden in twee grote open leesramen (ORF) ORF1a en ORF1b, die worden vertaald uit genomisch RNA van.ORF1a codeert voor polyproteïne (pp) 1a, en ORF1a en ORF1b coderen gezamenlijk voor pp1ab.Met de algemene deelname van het belangrijkste protease (Mpro), gecodeerd door ORF1a, worden zowel pp1a als pp1ab proteolytisch verwerkt tot een verscheidenheid aan niet-structurele eiwitten (nsps), ook bekend als 3CLpro, omdat het homologie heeft met het 3Cpro van het picornavirus ( 9).Er wordt aangenomen dat deze nsps worden samengevoegd tot een grote dynamische RTC, de synthese van genomisch RNA (replicatie) en een reeks subgenomisch RNA (transcriptie) katalyseren en worden gebruikt om de expressie van het ORF dat zich stroomafwaarts van ORF1b bevindt, te coördineren (10? ? ?12).
De kern-RTC omvat RNA-afhankelijke RNA-polymerase (RdRp) (13), helicase van superfamilie 1 (HEL1) (14, 15) en verschillende RNA-verwerkende enzymen, die voornamelijk worden gecodeerd in ORF1b en in de coronavirusfamilie. Het bevat nsp12-nsp16 en nsp9-nsp12 in de Arterioviridae-familie (zie referentie 10ââ 12).RdRp en HEL1 vertegenwoordigen twee (een vijfde) geconserveerde domeinen van het vogelnestvirus en hebben homologie met andere RNA-virussen.Aangenomen wordt dat kernreplicase wordt ondersteund door andere subeenheden, waaronder verschillende kleine nsps die worden vrijgegeven uit het carboxy-terminale (C-terminale) gebied van pp1a, stroomafwaarts van Mpro (respectievelijk coronavirus nsp5 en arterieel virus nsp4).Ze genieten beperkte gezinsspecifieke bescherming en diverse activiteiten (besproken in referentie 10âââ12).
Relatief recent werd een domein met unieke sequentiemotiefkenmerken gevonden aan het amino-uiteinde (N-uiteinde) grenzend aan RdRp in alle geneste virussen, maar geen andere RNA-virussen (16).Gebaseerd op zijn locatie en nucleotidetransferase (nucleoside monofosfaat [NMP] transferase) activiteit, wordt dit domein NiRAN (Nestvirus RdRp-related nucleotide transferase) genoemd.De dual-domein combinatie van NiRAN-RdRp vormt nsp12 in de Coronaviridae-familie en nsp9 in de Arterioviridae-familie, en in andere nestoviridae wordt verwacht dat NiRAN-RdRp zal worden vrijgegeven als een onafhankelijke nsp uit het virale polyproteïne.Bij het coronavirus bevat het NiRAN-domein ??1/450 residuen en is het via het linkergebied (16-19) verbonden met het C-terminale RdRp-domein.In Equine Arteritis Virus (EAV) (Arteriviridae) vertoont recombinant nsp9 Mn2+ ion-afhankelijke (zelf) UMPylatie- en GMPylatie-activiteiten, die afhankelijk zijn van drie geconserveerde sequentiebasen in nestovirus, AN, BN en CN. De residuen in de sequentie.Waar N staat voor NiRAN) (16).De N-terminale flankering van deze motieven is een minder conservatief preAN-motief.Sommige van deze residuen zijn ook geconserveerd in op afstand verwante proteïnekinasen, waarvan is aangetoond dat ze betrokken zijn bij nucleosidetrifosfaat (NTP)-binding en katalytische activiteit (20, 21).In overeenstemming met deze waarneming kunnen verschillende belangrijke residuen op de actieve plaats in het pseudokinase SelO van Pseudomonas syringae worden geassembleerd met het onlangs gepubliceerde SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 supercomplex.Geconserveerde NiRAN-residuen van het coronavirus bovenop de elektronenmicrostructuur.Recombinant eiwit (17).Er wordt gespeculeerd dat de gedocumenteerde (zelf) U/GMPylatie een tijdelijke toestand zal produceren om NMP over te dragen naar het (momenteel onbekende) substraat (16), en de structurele gelijkenis tussen NiRAN en proteïnekinase (17, 19). NiRAN modificeert andere eiwitten.
Veel kenmerken, waaronder de unieke en unieke systematische associatie met geneste virussen en genetische scheiding van RdRp, maken NiRAN tot een redelijk belangrijk regulerend enzym voor geneste virussen, wat cruciaal is voor hun opkomst en identiteit.Eerder werden drie mogelijke functies genoemd waarbij NiRAN betrokken was om genoom/subgenomische vertaling of replicatie/transcriptie te reguleren.Als we kijken naar de schaarse en onvolledige gegevens die op dat moment beschikbaar waren, heeft elke functie zijn voor- en nadelen (16).In dit onderzoek willen we de biochemische en omgekeerd genetische studies van de coronavirussen die de twee geslachten vertegenwoordigen combineren, en onze bevindingen in de evolutionaire achtergrond van de natuurlijke mutatie van de coronavirusfamilie plaatsen, om zo inzicht te krijgen in dit mysterieuze rijk.We rapporteren belangrijke vooruitgang in het begrip van NiRAN door de identificatie van natuurlijke doelwitten in RTC, wat (van de drie beschikbare hypothesen) bijdraagt aan de rol van dit domein bij het initiëren van de synthese van genest virus-RNA.Dit onderzoek opent ook mogelijkheden voor andere rollen van NiRAN op de virushostinterface.
Om de enzymatische eigenschappen van het aan het coronavirus nsp12 gerelateerde NiRAN-domein te karakteriseren, produceerden we een recombinante vorm van menselijk coronavirus 229E (HCoV-229E) nsp12 in E. coli, met een His6-tag aan het C-uiteinde, en combineerden we de eiwit met [α32-P] Incubeer samen met NTP in aanwezigheid van MnCl2 zoals beschreven in Materialen en methoden.De analyse van het reactieproduct duidde op de aanwezigheid van een radioactief gemerkt eiwit dat co-migreert met nsp12 (106 kDa), wat aangeeft dat coronavirus nsp12 de vorming katalyseert van covalente eiwit-NMP-adducten, bij voorkeur gevormd met uridinemonofosfaat (UMP) (Figuur 1A). B).Kwantitatieve analyse toonde aan dat, vergeleken met andere nucleotiden, de signaalintensiteit van UMP-opname 2 tot 3 keer toenam (Figuur 1C).Deze gegevens komen overeen met de voorspelde NMP-transferase-activiteit van het NiRAN-domein van het coronavirus (16), maar geven aan dat de nucleotidevoorkeuren van het NiRAN-domein van het coronavirus en het arteriële virus verschillend zijn.
Zelf-NMPyleringsactiviteit van HCoV-229E nsp12.(A) HCoV-229E nsp12-His6 (106 kDa) werd gedurende 30 minuten geïncubeerd met het aangegeven [a-32P] NTP in aanwezigheid van 6 mM MnCl2 (zie Materialen en methoden voor details).De reactieproducten werden gescheiden door SDS-PAGE en gekleurd met Coomassie briljant blauw.(B) Het radioactief gemerkte eiwit wordt gevisualiseerd door fosforbeeldvorming.De posities van nsp12-His6 en eiwitmolecuulmassamarkers (in kilodalton) worden weergegeven in A en B. (C) De intensiteit van het radioactieve signaal (gemiddelde ± SEM) werd bepaald op basis van drie onafhankelijke experimenten.*P≤0,05.De signaalsterkte (percentage) is gerelateerd aan UTP.
Hoewel is aangetoond dat NiRAN-gerelateerde enzymactiviteiten essentieel zijn voor de replicatie van EAV en SARS-CoV in celcultuur (16), zijn de specifieke NiRAN-functie en potentiële doelwitten nog niet bepaald.De onlangs gerapporteerde structurele gelijkenis tussen NiRAN en een familie van eiwitten met proteïnekinase-achtige vouwen (17, 22) heeft ons ertoe aangezet de hypothese te testen dat NiRAN de NMPylatie van andere eiwitten katalyseert.We hebben een reeks potentiële homologe doelwitten gegenereerd, waaronder niet-structurele eiwitten gecodeerd door HCoV-229E ORF1a (nsps 5, 7, 8, 9, 10), elk met een C-terminale His6-tag (SI-bijlage, tabel S1), en incubeer deze eiwitten met [α32-P] uridinetrifosfaat ([α32-P] UTP) in de aanwezigheid of afwezigheid van nsp12.Runderserumalbumine en MBP-LacZα-fusie-eiwit geproduceerd in E. coli dienden als controles (Figuur 2A, lanen 1 tot 7).Het radioactief gemerkte eiwit werd geanalyseerd door middel van natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) en autoradiografie, en er werd gevonden dat er een sterk radioactief signaal was in de reactie die nsp12 en nsp9 bevatte.De positie van het signaal komt overeen met de molecuulmassa van nsp9, wat nsp12-gemedieerde UMPylatie van nsp9 aangeeft (Figuur 2B, nummer 7).Er werd geen UMPylatie van andere testeiwitten gevonden, wat ons deed concluderen dat nsp9 een specifiek substraat van nsp12 is.In overeenstemming met de zelf-NMPyleringsgegevens weergegeven in figuur 1, is nsp12 in staat alle vier de NMP's over te dragen naar nsp9, hoewel de efficiëntie anders is: UMP> adenosinemonofosfaat (AMP)> guanosinemonofosfaat (GMP)> cytidinemonofosfaat (CMP)) ( Afbeelding).3 A en B).Onder de omstandigheden die in deze test worden gebruikt (verkort de reactie- en blootstellingstijd, verminder de concentratie van nsp12; materialen en methoden), kon de zelf-NMPylering van nsp12 niet worden gedetecteerd (vergelijk Figuur 2B, baan 7 en Figuur 1B), wat bleek een effectieve (en meerdere rondes) UMP verplaatst van nsp12 naar nsp9.UMP-transferase-activiteit vereist de aanwezigheid van Mn2+-ionen, zoals weergegeven in Figuur 3C, terwijl slechts minimale UMP-transferase-activiteit werd waargenomen in de aanwezigheid van Mg2+, en geen activiteit in de aanwezigheid van de andere twee geteste tweewaardige kationen.Soortgelijke gegevens werden verkregen in NMPylatietests die cytidinetrifosfaat (CTP), guanosinetrifosfaat (GTP) en adenosinetrifosfaat (ATP) bevatten (SI-bijlage, figuur S1).
HCoV-229E nsp12-gemedieerde UMPylatie van nsp9.Een reeks eiwitsubstraten (waaronder runderserumalbumine, MBP-lacZα en een reeks HCoV-229E-nsps gelabeld met C-terminale His6 gecodeerd door ORF1a) werden gebruikt om de UMPyleringsactiviteit van HCoV-229E nsp12-His6⁺-gemedieerde te evalueren. eiwit.Incubeer het eiwit met [α-32P] UTP gedurende 10 minuten in afwezigheid (A) of aanwezigheid (B) van nsp12, zoals beschreven in de materialen en methoden.Aan de bovenkant van A en B wordt SDS-polyacrylamidegel gekleurd met Coomassie Brilliant Blue getoond, en aan de onderkant van A en B worden de overeenkomstige autoradiogrammen getoond.De positie van de molecuulmassamarker van het eiwit (in kilodalton) wordt links weergegeven.De positie van nsp12-His6 (B, bovenaan) en het radioactieve signaal waargenomen tijdens de incubatie van nsp12-His6 met nsp9-His6 (B, baan 7) zijn ook aangegeven, wat aangeeft dat [α-32P]UMP naar nsp9-His6 (12,9 kDa), wat niet werd waargenomen voor andere geteste eiwitten.
HCoV-229E NiRAN-gemedieerde biochemische en virologische karakterisering van nsp9 NMPylatie.(A en B) De rol van het nucleotide-cosubstraat dat bij de reactie wordt gebruikt.Nsp12-His6 en nsp9-His6 worden gemengd en geïncubeerd in de aanwezigheid van verschillende [α-32P] NTP's in de standaard NMPylatietest.(A, boven) Met Coomassie gekleurd nsp9-His6 gescheiden door SDS-PAGE.(A, onder) Autoradiografie van hetzelfde gebied van de gel.(B) De relatieve activiteit (gemiddelde ± SEM) in aanwezigheid van de aangewezen nucleotide-cofactor wordt bepaald op basis van drie onafhankelijke experimenten.*P≤0,05.(C) De rol van metaalionen.Getoond wordt de standaard NMPylatietest in aanwezigheid van [α-32P] UTP en verschillende metaalionen, elk met een concentratie van 1 mM.In C, bovenaan, wordt Coomassie-gekleurd nsp9-His6 getoond, en in C, onderaan, wordt de overeenkomstige autoradiografie getoond.De grootte van het gelabelde eiwit (in kilodalton) wordt links van A en C weergegeven. (D) De mutante vorm van HCoV-229E nsp12-His6 die de gespecificeerde aminozuursubstitutie draagt, bevindt zich in [α-32P]UTP, zoals beschreven in materialen en methoden.Het radioactief gemerkte nsp9-His6 geproduceerd in de NMPyleringsreactie wordt gedetecteerd door fosforyleringsbeeldvorming (D, bovenaan).De relatieve activiteit vergeleken met het wildtype (wt) eiwit wordt weergegeven in D, en de bodem wordt genomen als het gemiddelde (±SEM) van drie onafhankelijke experimenten.Sterretjes geven vervangingen van niet-geconserveerde residuen aan.(E) De virustiter in het kweeksupernatant van pl-cellen verkregen 24 uur na infectie werd bepaald door middel van plaquetest.De codonsubstituties in het NiRAN-domein van de gemanipuleerde HCoV-229E-mutant zijn aangegeven (residunummering is gebaseerd op hun positie in pp1ab).De replicatiedeficiënte RdRp-mutant op de actieve plaats nsp12_DD4823/4AA werd als controle gebruikt.
Om een dieper inzicht te krijgen in de actieve plaats van NiRAN en de residuen te bepalen die verband houden met de activiteit van nsp9-specifieke NMP-transferase, hebben we mutatieanalyse uitgevoerd, waarbij we de conservatieve residuen in de NiRAN AN-, BN- en CN-motieven hebben vervangen ( 16) Het is Ala (SI-bijlage, figuur S2).Bovendien werd de impact van conservatieve Arg-naar-Lys- of Lys-naar-Arg-substituties in twee gevallen geëvalueerd.Als (negatieve) controle worden residuen die niet of minder geconserveerd zijn in het NiRAN-domein van coronavirussen en andere geneste virussen vervangen door Ala. Ter vervanging van K4116A (in motief preAN), K4135A (AN), R4178A (BN), D4188A (motief BN) en D4280A (CN) verminderen of elimineren zelfs nsp9 NMPylatie via nsp12, terwijl eiwitten met conservatieve substituties (R4178K), K4116R) 60% en 80% van hun activiteit behouden, wat erop wijst dat de versoepeling van de beperkingen aan hun respectievelijke kant ketens is fysisch-chemisch gevoelig (Figuur 3D).Het vervangen van verschillende andere geconserveerde residuen E4145A, D4273A, F4281A en D4283A is veel minder schadelijk, en nsp9 UMPylatie wordt slechts matig verminderd.Soortgelijke resultaten werden verkregen in nsp9 NMPylatiereacties waarbij andere NTP's betrokken waren (Figuur 3D en SI-bijlage, Figuur S3), wat bevestigt dat de waargenomen effecten op specifieke aminozuursubstituties onafhankelijk zijn van het gebruikte type nucleotide-co-substraat.Vervolgens hebben we de mogelijke impact van deze nsp12-substituties op de replicatie van coronavirussen in celcultuur getest.Voor dit doel gebruikten we geschikte genetisch gemanipuleerde complementaire DNA (cDNA)-matrijzen, gekloond in recombinant vacciniavirus (23, 24) om 5-7 cellen te transcriberen.Titratie van nageslacht van infectieuze virussen geproduceerd in deze cellen toonde aan dat de meeste HCoV-229E NiRAN-mutanten niet haalbaar waren (Figuur 3E).Een groep niet-levensvatbare virale mutanten omvat alternatieven waarvan is aangetoond dat ze de NMP-transferase-activiteit in vitro elimineren of aanzienlijk verminderen (K4116A, K4135A, R4178A, D4188A, D4280A, D4283A), maar er zijn twee andere alternatieven (K4116R, E4145A) 80 % gereserveerd?Hun in vitro NMPyleringsactiviteit suggereert dat er extra beperkingen bij betrokken zijn.Op vergelijkbare wijze produceerden twee andere mutaties (R4178K, F4281A) die een matige afname van de in vitro NMPylatie-activiteit van NiRAN veroorzaakten, levende virussen, maar deze virussen verminderden de titers aanzienlijk door replicatie.Consistent met de in vitro-activiteitsgegevens getoond in Figuur 3D, ter vervanging van vier andere residuen die niet geconserveerd zijn in het coronavirus en/of andere geneste virussen (K4113A, D4180A, D4197A, D4273A) (8, 16), produceerden levensvatbare virussen. De nakomelingen, ondanks dat ze een matig verlaagde titer vergeleken met het wildtype virus (Figuur 3E).
Om te onderzoeken of NiRAN-gemedieerde NMP-transferase-activiteit afhangt van het actieve RdRp-domein, werden de twee geconserveerde Asp-residuen die betrokken zijn bij de coördinatie van tweewaardige metaalionen (11) in RdRp-motief C vervangen door Ala. Het resulterende eiwit nsp12_DD4823/4AA behoudt de nsp9 NMPylatie-activiteit ervan, wat aangeeft dat nsp12-gemedieerde in vitro nsp9 NMPylatie-activiteit geen polymerase-activiteit vereist (SI-bijlage, figuur S4).
Na het vaststellen van de nsp9-specifieke NMP-transferase-activiteit voor nsp12, probeerden we het NMP-nsp9-adduct te karakteriseren met behulp van massaspectrometrie (MS).Het volledige eiwitmassaspectrum van recombinant HCoV-229E nsp9 vertoonde een piek bij 12.045 Da (Figuur 4A).De toevoeging van nsp12 veranderde de kwaliteit van nsp9 niet, wat aangeeft dat nsp12 en nsp9 geen stabiel complex zouden vormen onder de gebruikte omstandigheden (denaturatie) (Figuur 4A).In de aanwezigheid van UTP en GTP toonde de massameting van de reactie die respectievelijk nsp9 en nsp12 bevatte aan dat de eiwitmassa van UTP 306 Da bewoog, en de eiwitmassa van GTP 345 Da bewoog, wat aangeeft dat elk nsp9-molecuul een UMP of GMP bindt. (Afbeelding 4) C en D).Er wordt gespeculeerd dat de energie die nodig is voor NiRAN-gemedieerde nsp9 NMPylering afkomstig is van NTP-hydrolyse en pyrofosfaatafgifte.Hoewel bij deze reactie een 10-voudige molaire overmaat van nsp9 (doelwit) dan nsp12 (enzym) werd gebruikt, werd een bijna volledige NMPylering van nsp9 waargenomen, wat erop wijst dat de interactie tussen nsp12 en nsp9 van korte duur is en dat nsp12 meer nsp9 kan NMPyleren. in vitro molecuul.
Enkelvoudige NMPylering van nsp9 in aanwezigheid van nsp12 en UTP of GTP.Getoond wordt het gedeconvolueerde volledige eiwitmassaspectrum van HCoV-229E nsp9 (SI-bijlage, Tabel S1) (AD).(A) nsp9 alleen, (B) nsp9 + nsp12-His6, (C) nsp9 + nsp12-His6 in de aanwezigheid van UTP, (D) nsp9 + nsp12-His6 in de aanwezigheid van GTP.
Om de door nsp12 geUMpyleerd nsp9-residuen te bepalen, werd nsp9-UMP gesplitst met trypsine.De resulterende peptiden werden gescheiden door nano-high performance vloeistofchromatografie (HPLC) en online geanalyseerd met tandemmassaspectrometrie (MS/MS).Gegevensanalyse met behulp van het Byonic-softwarepakket (Protein Metrics) toonde UMPylatie van het N-terminale aminozuur aan.Dit wordt handmatig bevestigd.Het tandemmassaspectrum van het voorloperpeptide [UMP]NNEIMPGK (SI-bijlage, Figuur S5A) onthulde een fragment bij 421 m/z, wat aangeeft dat UMP bindt aan residu 1 van nsp9.
Aan het N-uiteinde van nsp9 is Asn geconserveerd onder de leden van Orthocoronavirinae (SI-bijlage, figuur S6).Hoewel wij geloven dat de N-terminale primaire aminestikstof de meest waarschijnlijke acceptor voor UMP is, hebben we besloten aanvullend bewijs te verkrijgen van NMP-binding aan de N-terminal.Om deze reden werd het niet-NMPyleerde en NMPyleerde N-terminale peptide nsp9, gezuiverd door HPLC, afgeleid in aanwezigheid van aceton en natriumcyanoboorhydride.Onder deze omstandigheden kunnen alleen vrije primaire aminen worden gemodificeerd met propyl (25).Het N-terminale, van nsp9 afkomstige peptide met de sequentie NNEIMPGK bevat twee primaire aminen, één aan de N-terminus van Asn en de andere aan de zijketen van Lys aan de C-terminus.Daarom kunnen aan beide uiteinden propylgroepen worden geïntroduceerd.De geëxtraheerde ionenchromatogrammen van niet-NMPyleerde peptiden worden getoond in de SI-bijlage, Figuur S5B.Zoals verwacht kunnen N-terminale en C-terminale (mono)propyleerde (SI-appendix, Figuur S5B, bovenste baan) en dipropyleerde peptiden (SI-appendix, Figuur S5B, onderste baan) worden geïdentificeerd.Dit patroon verandert met het gebruik van het NMPylated N-terminale peptide van nsp9.In dit geval kunnen alleen C-terminale gepropyleerde peptiden worden geïdentificeerd, maar N-terminale gepropyleerde peptiden en dipropyleerde peptiden worden niet geïdentificeerd (SI-bijlage, figuur S5C), wat aangeeft dat UMP is overgebracht naar het N-terminale primaire amine. groep geen veranderingen doorvoeren.
Vervolgens vervangen we (door Ala of Ser) of verwijderen we de geconserveerde residuen aan de N-terminus van nsp9 om doelspecifieke beperkingen te definiëren.Gebaseerd op onze MS-gegevens die aantonen dat NiRAN een nsp9-NMP-adduct vormt met het primaire amine van het N-terminale residu van nsp9, veronderstelden we dat nsp9 NMPylatie vereist dat het virale masterprotease (Mpro, nsp5) het nsp9 N-terminale residu vrijgeeft van zijn polyproteïnevoorloper.Om deze hypothese te testen, produceerden we een precursoreiwit nsp7-11 dat nsp9 bevat in E. coli en voerden we een standaard NMPylatietest uit in aanwezigheid van [α-32P] UTP (materialen en methoden).Zoals getoond in Figuur 5A (laan 3) is de ongesneden nsp7-11-precursor niet radioactief gemerkt met nsp12.Als nsp7-11 daarentegen wordt gesplitst door recombinant nsp5 om nsp9 (en andere nsp's) vrij te maken van de precursor, wordt een radioactief gemerkt eiwit dat met nsp9 migreert gedetecteerd, wat onze conclusie bevestigt dat NiRAN en N-selectieve vorming van covalente nsp9-NMP-adducten .Het terminale primaire amine van de N-terminale Asn (positie 3825 in pp1a/pp1ab).Deze conclusie wordt ook ondersteund door experimenten met het nsp9-construct, dat één of twee extra residuen aan de N-terminus bevat.In beide gevallen werd NiRAN-gemedieerde UMPylatie van nsp9 afgeschaft (SI-bijlage, figuur S7).Vervolgens produceerden we een eiwit met één of twee Asn-residuen verwijderd uit de 3825-NNEIMPK-3832-peptidesequentie aan de N-terminal van nsp9.In beide gevallen werd nsp9 UMPylatie volledig geblokkeerd (Figuur 5B), wat aanvullend bewijs levert dat de echte nsp9 N-terminus fungeert als een NMP-receptor.
De proteolytische verwerking van nsp9 en de rol van N-terminale residuen in nsp12-gemedieerde UMPylatie.(A) nsp9 UMPylatie vereist een vrije nsp9 N-terminal.Nsp7-11-His6 wordt voorgeïncubeerd bij 30 °C in NMPylatiedetectiebuffer die UTP bevat in de aanwezigheid of afwezigheid van recombinant Mpro (nsp5-His6).Start na 3 uur de NMPylatietest door nsp12-His6 toe te voegen zoals beschreven in Materialen en methoden.De reactie die nsp5-His6 (laan 1) en nsp9-His6 (laan 2) bevatte, werd als controle gebruikt.Na 10 minuten werd de reactie beëindigd en werd het reactiemengsel gescheiden door middel van SDS-PAGE.Het eiwit werd gekleurd met Coomassie Brilliant Blue (A, bovenaan).De Nsp7-11-His6-voorloper en het verwerkte product dat resulteert uit door nsp5-His6 gemedieerde splitsing worden rechts getoond.Houd er rekening mee (vanwege hun kleine formaat) dat nsp7 en nsp11-His6 niet detecteerbaar zijn in deze gel en dat de reactie wordt aangevuld met nsp5-His6 (lanen 1 en 4; de positie van nsp5-His6 wordt aangegeven door een dichte cirkel) of nsp9-His6 (laan 2) bevat een kleine hoeveelheid MBP (aangegeven door open cirkels) als resterende onzuiverheden omdat ze worden uitgedrukt als MBP-fusie-eiwitten (SI-bijlage, tabel S1).(B) De Nsp9-His6-variant mist één of twee N-terminale Asn-residuen (residunummering volgens de positie in pp1a/pp1ab) en wordt gezuiverd en geïncubeerd met nsp12-His6 en [α-32P] UTP.B, SDS-PAGE gekleurd met Coomassie wordt bovenaan getoond, B, het overeenkomstige autoradiografie wordt onderaan getoond.De positie van de molecuulgewichtsmarker (in kilodalton) wordt links weergegeven.(C) HCoV-229E nsp9-His6 N-terminale geconserveerde residuen werden vervangen door Ala of Ser, en dezelfde hoeveelheid eiwit werd gebruikt in de door nsp12-His6 gemedieerde UMPyleringsreactie.De reactieproducten werden gescheiden door SDS-PAGE en gekleurd met Coomassie Brilliant Blue (C, bovenaan), en radioactief gemerkt nsp9-His6 werd gedetecteerd door middel van fosforescentiebeeldvorming (C, midden).Met behulp van wildtype (gew.) eiwit als referentie (ingesteld op 100%) werd de relatieve NMPyleringsactiviteit (gemiddelde ± SEM) berekend op basis van drie onafhankelijke experimenten.(D) Virustiters in het supernatant van de p1-celkweek van Huh-7-cellen geïnfecteerd met HCoV-229E wildtype Huh-7-cellen, en mutanten die aangewezen aminozuursubstituties in nsp9 dragen, werden bepaald door middel van plaque-assay.De replicatiedeficiënte RdRp-motief C-dubbelmutant DD4823/4AA werd als negatieve controle gebruikt.
Het N-uiteinde van nsp9 (vooral posities 1, 2, 3 en 6) is zeer geconserveerd onder leden van de Orthocoronavirinae-subfamilie (SI-bijlage, figuur S6).Om de mogelijke rol van deze residuen bij nsp12-gemedieerde nsp9-NMPylering te bestuderen, werden twee opeenvolgende Asn-residuen aan de N-terminus van nsp9 vervangen door Ala of Ser (alleen of in combinatie).Vergeleken met wildtype nsp9 resulteerde het vervangen van N3825 door Ala of Ser in een meer dan tweevoudige reductie in door nsp12 gemedieerde UMPylatie (Figuur 5C).In overeenstemming met onze conclusie dat NMPylatie plaatsvindt aan het N-terminale primaire amine in plaats van aan de zijketen van het N-terminale residu, hebben we significante resterende NMPylatie waargenomen met de vervanging van N3825A en N3825S.Interessant is dat als de tweede Asn wordt vervangen door Ala of Ser, de nsp9 UMPylatie sterker wordt verminderd (meer dan 10 keer), terwijl de vervanging van Ala op posities 3, 4 en 6 slechts een matig effect heeft op nsp9 UMPylatie (Figuur 2). ).5C).Soortgelijke resultaten werden verkregen met behulp van ATP, CTP of GTP (SI-bijlage, figuur S8).Gezamenlijk duiden deze gegevens op de sleutelrol van N2826 (positie 2 in nsp9) bij nsp9-NMPylatie.
Om aanvullend bewijs te verkrijgen van de functionele correlatie tussen de N-terminus van nsp9 en NMPylatie, hebben we een meervoudige sequentie-uitlijning (MSA) uitgevoerd van de nsp9-sequentie van de Coronavirus-familie (variërend tussen 104 en 113 residuen) (SI-bijlage, figuur S6).In totaal bleken van de 47 (bekende en vermeende) soorten van 5 geslachten van de Orthocoronavirinae-subfamilie die verschillende zoogdieren, vogels en reptielen infecteren, in totaal slechts 8 residuen invariant te zijn.De meest uitgebreide veranderingen, inclusief deleties en inserties, werden waargenomen in de cycli tussen de secundaire structuurelementen van nsp9, zoals bepaald door eerdere structurele studies (26 ??28).Er werden vijf invariante residuen gevonden in de β-streng en α-helix van het C-terminale deel van nsp9.Drie invariante residuen vormen het NNE-motief van de N-terminus van nsp9.Er wordt onthuld dat de tweede Asn van dit motief het enige invariante residu is, dat ook wordt gedeeld door de hypothetische nsp9 van het ver verwante kikkercoronavirus, en de Microhyla letovirus 1-soort vertegenwoordigt in de onderfamilie Letovirinae van Alphaletovirus.Het behoud van residuen in secundaire structuurelementen van nsp9 kan worden gerationaliseerd door structurele overwegingen om vouwing of bekende RNA-bindende eigenschappen te behouden.Deze redenering lijkt echter niet van toepassing te zijn op het behoud van NNE, en voorafgaand aan deze studie was de aard van de beperkingen die de variatie van de tripeptidesequentie beperken volledig onduidelijk.
Om het belang van nsp9-NMPylatie en NNE-conservering bij de replicatie van coronavirus te bepalen, hebben we HCoV-229E-mutanten geproduceerd, die enkele of dubbele substituties van nsp9 N-terminale residuen dragen, wat aangeeft dat nsp9-NMPylatie in vitro schadelijk is.Voordat we beginnen proberen we de vraag te beantwoorden of deze substituties (in de buurt van de nsp8|9-splitsingsplaats) de proteolytische verwerking van het C-terminale pp1a-gebied beïnvloeden.Een reeks nsp7-11-polyproteïneconstructen die overeenkomstige substituties aan de N-terminus van nsp9 bevatten, werd geproduceerd in E. coli en geknipt met recombinant Mpro.De proteolytische splitsing van de vier plaatsen (inclusief de flankerende nsp9-plaats) wordt niet significant beïnvloed door geïntroduceerde substituties (SI-bijlage, Figuur S9), met uitzondering van structurele veranderingen in deze eiwitten die interfereren met Mpro-gemedieerde nsp8 | 9-splitsing (of andere) website.
Huh-7-cellen werden getransfecteerd met HCoV-229E-RNA van genoomlengte, dat codeert voor Ala- of Ser-substituties in de geconserveerde NNE-tripeptiden (N3825, N3826 en E3827) aan het nsp9-N-uiteinde, wat aantoont dat de meeste mutaties fataal zijn.We konden het virus redden door de Ser of Ala van de N-terminale Asn (N2835A of N2835S) te vervangen, maar slaagden er niet in het virus te herstellen met andere enkele en dubbele mutaties in de NNE-sequentie (N3826A, N3826S, NN3825/6AA, NN3825/6SS), E3827A) (Figuur 5D).
Deze resultaten geven aan dat de replicatie van coronavirussen in weefselkweek beperkt is (hetzelfde of vergelijkbaar), waardoor de natuurlijke mutatie van nsp9 NMPylatieplaatsen in het lichaam wordt beperkt en de sleutelrol van deze reactie in de levenscyclus van coronavirussen wordt ondersteund.
In de laatste reeks experimenten produceerden we C-terminale His6-gelabelde SARS-CoV-2 nsp12 en nsp9, en twee mutante vormen van nsp12 in E. coli.De residuen op de actieve plaats in de NiRAN- en RdRp-domeinen waren respectievelijk Use Ala (Figuur 6A en SI-bijlage, Tabel S2).K4465 in SARS-CoV-2 nsp12 komt overeen met K4135 in HCoV-229E (SI-bijlage, figuur S2), wat nodig bleek te zijn voor NiRAN-activiteit en HCoV-229E-replicatie (figuur 3D en E).Dit residu komt ook overeen met het arteriële virus EAV nsp9 K94-residu, waarvan eerder werd aangetoond dat het noodzakelijk is voor NiRAN-zelf-UMPylatie/zelf-GMPylatie (16).Zoals getoond in Figuur 6B heeft SARS-CoV-2 nsp12 UMP-transferase-activiteit met behulp van nsp9 als substraat, terwijl de nsp12_K4465A-mutant op de actieve plaats inactief is.De dubbele substitutie in de karakteristieke SDD-sequentie van RdRp-motief C heeft geen invloed op de UMP-transferase-activiteit (Figuur 6B), wat aangeeft dat RdRp-activiteit geen direct effect heeft op nsp9-UMPylatie.Soortgelijke gegevens werden verkregen met behulp van CTP, GTP en ATP (SI-bijlage, figuur S10).Samenvattend geven deze gegevens aan dat NiRAN-gemedieerde nsp9-NMPylering een conservatieve activiteit heeft in coronavirussen die verschillende geslachten van de orthocoronavirus-subfamilie vertegenwoordigen.
SARS-CoV-2 nsp12-gemedieerde NMPylatie van nsp9.(A) Coomassie-gekleurde SDS-polyacrylamidegel die het recombinante eiwit toont dat werd gebruikt in de NMPylatietest.Als controle werd een mutant eiwit met actieve plaatssubstitutie in het NiRAN-domein (K4465A) en RdRp-domein (DD5152/3AA) van SARS-CoV-2 nsp12 gebruikt.De restnummering is gebaseerd op de positie in pp1ab.(B) Autoradiogram van UMPylatie-detectie met behulp van nsp9-His6 en [α-32P]UTP als het substraat van nsp12-His6 (wildtype [wt] en mutant).De moleculaire massa (in kilodalton) van het gelabelde eiwit wordt links weergegeven.
NiRAN-domeinen zijn over het algemeen geconserveerd in Nidovirales (16), wat aangeeft dat ze enzymatische reacties katalyseren die essentieel zijn voor de replicatie van Nidovirus.In deze studie konden we bewijzen dat het NiRAN-domein van het coronavirus NMP (gegenereerd door NTP) overdraagt naar nsp9, een mysterieus RNA-bindend eiwit dat betrokken is bij virusreplicatie (26 ??29), om het te bepalen als een natuurlijk doelwit en partner van coronavirus RTC.
Het NiRAN-domein deelt drie sequentiemotieven (AN, BN en CN), die een zeer klein aantal residuen bevatten die in alle families geconserveerd zijn in de monofyletische maar sterk gedifferentieerde Nidovirales-orde (8, 16).Recente onderzoeken hebben aangetoond dat ze structureel verwant zijn aan een grotendeels ongekarakteriseerde familie van proteïnekinase-achtige eiwitten, die oorspronkelijk de SelO-familie werden genoemd (17, 19, 22, 30, 31).SelO-gerelateerde eiwitten hebben kinaseplooien, maar missen verschillende geconserveerde actieve plaatsresiduen in klassieke kinasen (22, 32).Gebaseerd op de omgekeerde oriëntatie van ATP-moleculen gebonden aan de actieve plaats en gestabiliseerd door specifieke interacties, werd de hypothese en vervolgens bevestigd dat SelO AMP (in plaats van fosfaat) naar het eiwitsubstraat overbrengt (22), terwijl een ander bacterieel SelO-achtig eiwit YdiU dit heeft gedaan. Onlangs is aangetoond dat het de covalente hechting van UMP aan Tyr- en His-residuen van verschillende eiwitsubstraten katalyseert (33).
Om de voorspelling van de vermeende actieve site-residuen van het NiRAN-domein van het coronavirus te bevestigen en uit te breiden, hebben we biochemische en omgekeerde genetica-methoden gebruikt om mutatieanalyses uit te voeren op het coronavirus nsp12 (Figuur 3D en E- en SI-bijlage, Figuur S3 en tabel). S4).Uit de gegevens blijkt dat de vervanging van HCoV-229E K4135, R4178 en D4280 door Ala de in vitro NMP-transferase-activiteit en virusreplicatie in celkweek elimineert (Figuur 3D en E- en SI-bijlagen, Figuur S3), wat hun aanwezigheid in NTP-γ-fosfaat ondersteunt. (K4135, R4178) en de coördinatie van metaalionen op de actieve plaats (D4280).Er werd aangetoond dat de E4145A-substitutie van het geconserveerde Glu in het bereik van het vogelnestvirus dat naar verwachting de K4135 (17)-positie zou stabiliseren de virale replicatie elimineert, maar verrassend genoeg bleef de activiteit behouden in de in vitro NMPylatietest (Figuur 3D en E en SI-bijlage, figuur S3 en tabellen S1-S4).Een soortgelijke waarneming werd gedaan toen de overeenkomstige substitutie werd geïntroduceerd in de YdiU-homoloog van Salmonella typhimurium (E130A) (33).Alles bij elkaar ondersteunen deze gegevens de regulerende functie van dit geconserveerde residu in plaats van de katalytische functie.
Het vervangen van het geconserveerde Phe-residu (F4281A) binnen het bereik van nestovirus in het HCoV-229E NiRAN-domein (8) resulteerde in een afname van NMPylatie-activiteit in vitro en een significante afname van virusreplicatie in celcultuur (Figuur 3D, E en SI) bijlage, figuur S3).De gegevens komen overeen met de belangrijke regulerende functie van dit residu, zoals het eerder getoonde homologe DFG-motief Phe-residu.Bij klassieke proteïnekinasen maakt het deel uit van de Mg2+-bindende lus en helpt het bij het samenstellen en reguleren van de wervelkolom???Vereist voor effectieve katalytische activiteit (32, 34).Het vervangen van respectievelijk Ala en Arg voor K4116-residuen (in het preAN-motief) elimineerde virale replicatie en had, zoals verwacht, verschillende effecten op NMP-transferase-activiteit in vitro, afhankelijk van de geïntroduceerde aminozuurzijketen (Figuur 3D en E- en SI-bijlagen). , Figuur S3).De functionele gegevens komen overeen met de structurele informatie, wat aangeeft dat dit residu een interactie met ATP-fosfaat tot stand heeft gebracht (17).In het NiRAN-domein van andere geneste virusfamilies wordt de positie van HCoV-229E pp1a/pp1ab K4116 ingenomen door Lys, Arg of His (8), wat aangeeft dat de functionele beperking van dit specifieke residu is versoepeld.De vervanging van D4188A en D4283A elimineert of vermindert de enzymactiviteit sterk en elimineert virusreplicatie (Figuur 3).Deze twee residuen zijn geconserveerd in de meeste (maar niet alle) geneste virussen (8), wat wijst op een belangrijke familiespecifieke maar mogelijk niet-katalytische functie.Ala-substituties van verschillende andere Lys- en Asp-residuen (K4113A, D4180A, D4197A en D4273A) die niet geconserveerd zijn in de Coronaviridae of andere Nestioviridae-families (8) werden als controles gebruikt.Zoals verwacht zijn deze substituties grotendeels draaglijk, met in sommige gevallen een lichte afname van de enzymactiviteit en virale replicatie (Figuur 3 en SI-bijlage, Figuur S3).Over het geheel genomen zijn de gegevens over mutagenese van het coronavirus zeer consistent met de zelf-GMP- en reverse genetica-gegevens van EAV NiRAN-RdRp (16), waarin EAV nsp9 (coronavirus nsp12 ortholoog) residu K94 (overeenkomend met HCoV-229E K4135) belangrijke functies vervult), R124 (komt overeen met R4178), D132 (komt overeen met D4188), D165 (komt overeen met D4280), F166 (komt overeen met F4281).Bovendien zijn de HCoV-229E-mutagenesegegevens consistent met en uitgebreid met de eerder gerapporteerde SARS-CoV reverse genetics-gegevens (16), net zoals zeer vergelijkbaar met die waargenomen voor het overeenkomstige CN-motief Phe-to-Ala-mutant SARS-CoV_nsp12. beschreven fenotype -F219A en HCoV-229E_F4281A (Figuur 3 D en E en SI-bijlage, Figuur S3 en Tabel S1-S4).
Vergeleken met EAV-orthologen (16), die een duidelijke voorkeur hebben voor UTP en GTP (in de zelf-NMPylatiereactie), laat onze studie zien dat het NiRAN-domein van het coronavirus (vertegenwoordigd door HCoV-229E en SARS-CoV-2) effectief kan worden overgedragen Alle vier de NMP's, hoewel er een lichte voorkeur is voor UMP (Figuur 1 en 3).De relatief lage specificiteit van het specifieke NTP-co-substraat komt overeen met de onlangs gerapporteerde SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 supercomposietstructuur, waarin ADP-Mg2+ bindt aan de actieve plaats van NiRAN, maar niet aan adenine. van de vorming van specifieke interacties (17).In onze studie heeft het type nucleotide dat wordt gebruikt in de NMPyleringsreactie geen differentieel effect op de activiteit van het mutante eiwit (SI-bijlage, Figuur S3), wat aangeeft dat geen van deze residuen nauw verwant is aan de binding van een specifieke nucleobase.De structurele basis en potentiële biologische betekenis van de verschillende NTP-co-substraatvoorkeuren waargenomen in de NiRAN-domeinen van coronavirussen en arteriële virussen moeten nog worden bestudeerd;ze kunnen waar zijn of kunnen te wijten zijn aan de beperkingen van hun respectievelijke onderzoeken.Op dit moment kan niet worden uitgesloten dat de potentiële NMPylator-activiteit van het NiRAN-domein van het arteriële virus (vergeleken met de eerder gekarakteriseerde zelf-NMPylatie-activiteit) een andere co-substraatvoorkeur heeft, rekening houdend met het feit dat de gelijkenis tussen het arteriële en het coronavirus Het NiRAN-domein heeft zijn limiet bereikt.Op reeksen gebaseerde vergelijking (16).Vergeleken met het pseudokinase SelO, dat Mg2+ als cofactor gebruikt, is de activiteit van het coronavirus en het arteriële virus NiRAN afhankelijk van Mn2+ (16) (Figuur 3C en SI-bijlage, Figuur S1).De Mn2+-afhankelijkheid en duidelijke voorkeur voor UTP is een ongebruikelijk kenmerk van eiwit-NMPylators, en is pas onlangs bevestigd in het YdiU-eiwit van Salmonella typhimurium, dat de strikte Mn2+-afhankelijke eiwitchaperonne UMPylatie katalyseert om cellen te beschermen tegen stressinductie. 33).
De onlangs beschreven structurele gelijkenis tussen het NiRAN-domein van het coronavirus en cellulaire proteïnekinasen (17, 19) biedt aanvullende ondersteuning voor het vermogen van NiRAN om NMP covalent te koppelen aan andere eiwitten die we in deze studie hebben gerapporteerd.We hebben onze zoektocht naar mogelijke NiRAN-doelen gericht op de eiwitten die worden gecodeerd door HCoV-229E ORF1a, waarvan bekend is dat ze direct of indirect RTC's ORF1b-gecodeerde replicase ondersteunen (12, 35).Onze experimenten leveren overtuigend bewijs voor de effectieve en specifieke NMPylatie van nsp9 (Figuur 2).Als het doeleiwit wordt gebruikt in een molaire overmaat die 8 tot 10 keer hoger is dan die van het enzym (nsp12), wordt bevestigd dat nsp9 volledig (mono)NMP is gemaakt (Figuur 4).We concludeerden dat de interactie tussen nsp12 en nsp9 van korte duur is en geen stabiel complex zal vormen met nsp9 (bij afwezigheid van andere RTC-subeenheden).Deze conclusie wordt ondersteund door eiwitinteractiestudies met het SARS-CoV-proteoom (35).MS-analyse identificeerde het primaire amine van het N-terminale residu van nsp9 als de NMPyleringsplaats (SI-bijlage, Figuur S5).De vorming van de fosforamidaatbinding en de N-terminale aminogroep onderscheidt de NiRAN-gemedieerde NMPyleringsactiviteit van de Pseudomonas syringae SelO-gemedieerde AMPyleringsreactie, die de vorming van O-gekoppeld AMP op Ser-, Thr- of Tyr-residuen katalyseert. 22), en S. typhimurium YdiU vormt O-gekoppelde (met Tyr) en N-gekoppelde (met His) peptide-UMP-adducten.De beperkte informatie die beschikbaar is over de SelO-eiwitfamilie geeft aan dat leden van deze grote eiwitfamilie sterk verschillen in de vorming van peptide-NMP-adducten.Dit is een interessante observatie die verder onderzoek verdient.
De gegevens verkregen in deze studie brachten ons tot de hypothese dat de NMPylering van nsp9 een vrije N-terminus vereist.In de context van virale replicatie zal dit worden gerealiseerd door de proteolytische splitsing van de nsp8|nsp9-verwerkingsplaats in het replicase-polyproteïne pp1a, gemedieerd door Mpro en pp1ab.Bij de meeste coronavirussen is het verschil tussen deze specifieke plaats (VKLQ|NNEI in HCoV-229E) en alle andere Mpro-splitsingsplaatsen van het coronavirus dat Asn (in plaats van een ander klein residu, zoals Ala, Ser of Gly) P1â bezet???Locatie (36).De peptidesplitsingsgegevens verkregen in de vroege onderzoeken toonden aan dat de splitsingsefficiëntie van de nsp8|nsp9-plaats lager was dan die van andere plaatsen, wat aangeeft dat 1) deze specifieke plaats een regulerende rol kan spelen bij de tijdige gecoördineerde verwerking van de C-terminale pp1a-regio, of 2) a De rol van de speciaal geconserveerde nsp9 N-terminus bij virusreplicatie (37).Onze gegevens (Figuur 5A) toonden aan dat de recombinante vorm van nsp9 die de echte N-terminale sequentie draagt, effectief werd geNMMPiseerd door nsp12.De N-terminale flankerende sequentie werd verwijderd door factor Xa (nsp9-His6; SI-bijlage, Tabel S1) of Mpro-gemedieerde splitsing (nsp7-11-His6; Figuur 5A en SI-bijlage, Tabel S1).Belangrijk is dat de ongesneden nsp9-bevattende voorloper nsp7-11-His6 resistentie vertoonde tegen NMPylering van nsp12, wat consistent is met onze gegevens, wat aangeeft dat het nsp9-NMP-adduct wordt gevormd via het N-terminale primaire amine (SI-bijlage, Figuur S5) .Om een dieper inzicht te krijgen in de specificiteit van het NiRAN-substraat, hebben we ons vervolgens geconcentreerd op de aangrenzende N-terminale residuen van nsp9.Bij afwezigheid van andere eiwitten zijn ze structureel flexibel, waardoor ze niet kunnen worden gedetecteerd in de ongelabelde vorm van nsp9 (26 28, 38), wat hun beperkte natuurlijke variatie aangeeft. Dit komt door de belangrijke sequentiespecifieke (niet secundaire structuurgerelateerde) functie van het nsp9 N-terminale fragment.Ala-substituties van geconserveerde residuen in dit gebied (figuren 5C en D en SI-bijlage, figuur S8) laten zien dat N3826 essentieel is voor nsp9-NMPylatie in vitro, terwijl N3825A- en E3827A-substituties leiden tot een afname van NMPylatie, terwijl M3829A- en P3830A-substituties dat niet doen. .Uiteraard van invloed op nsp9 NMPylation.Hoewel de substitutie van N-terminale Asn (N3825A, N3825S) slechts een matig effect heeft op nsp9 NMPylatie en virusreplicatie in celcultuur (Figuur 5C en D), is de verwijdering van een Asn-residusequentie uit het N-terminale 3825-NN-dipeptide bleek te zijn. Het is dodelijk voor virussen, wat aangeeft dat één Asn-residu vereist is vóór een ander residu aan de N-terminus, bij voorkeur Asn, hoewel het erop lijkt dat vervanging van vergelijkbare residuen gedeeltelijk kan worden getolereerd (Figuur 5B, C en D).We concluderen dat het 3825-NN-dipeptide, vooral het geconserveerde en essentiële N3826-residu binnen het coronavirusbereik (SI-bijlage, Figuur S6), zorgt voor de juiste binding en oriëntatie van het nsp9 N-uiteinde in de actieve plaats van NiRAN.
Door Ala (E3827A) te vervangen door de geconserveerde Glu van alle subfamilies, blijft nsp9 NMPylatie in vitro behouden, maar is dodelijk voor virussen in celcultuur (Figuur 5C en D), wat de extra functie van dit residu aangeeft, bijvoorbeeld bij belangrijke interacties (NMPylated of ongemodificeerde ) nsp9 N-terminus en andere factoren die betrokken zijn bij virusreplicatie.Nsp9-mutaties hadden geen invloed op het proteolytische proces van nsp9 of enige aangrenzende nsp (39) (SI-bijlage, figuur S9), wat aangeeft dat de dodelijke fenotypes van verschillende waargenomen nsp9-mutaties niet werden veroorzaakt door de ontregeling van het C-proteolytische proces-terminale pp1a-gebied .
De bovenstaande gegevens leveren bewijs dat na Mpro-gemedieerde behandeling van de nsp8|9-splitsingsplaats in pp1a/pp1ab, de N-terminus van nsp9 kan worden geUMpyleerd (of gedeeltelijk kan worden gemodificeerd met een ander NMP).Bovendien leidden de uitstekende conservering van de N-terminus van nsp9 (inclusief de enkelvoudige en invariante Asn-residuen in de coronavirusfamilie) en de reverse genetica-gegevens verkregen in deze studie (figuren 3E en 5D) ons tot de conclusie dat de beschreven nsp9-NMPylatie is biologisch verwant en essentieel voor de replicatie van het coronavirus.De functionele consequenties van deze modificatie moeten nog worden bestudeerd, bijvoorbeeld met betrekking tot de eerder beschreven (niet-specifieke) nsp9 (ongemodificeerde vorm) RNA-bindende activiteit (2628).N-terminale NMPylatie kan ook de interactie van nsp9 met eiwit- of RNA-substraten of de vorming van verschillende assemblages op vier niveaus beïnvloeden.Deze zijn waargenomen in structurele onderzoeken en er is bevestigd dat ze functioneel gerelateerd zijn aan de replicatie van het coronavirus, hoewel vooral bij afwezigheid van In het geval van deze wijziging (26-29, 40).
Hoewel de doelspecificiteit van het coronavirus NiRAN-domein nog gedetailleerder moet worden gekarakteriseerd, laten onze gegevens zien dat de eiwitdoelspecificiteit van het coronavirus NiRAN-domein erg smal is.Hoewel de conservering van belangrijke actieve plaatsresiduen (8, 16) in het NiRAN-domein van alle nidovirusfamilies de activiteit van de geconserveerde NMPylator van deze eiwitten sterk ondersteunt, moet de identiteit van de substraatbindende pocketresiduen van dit domein nog worden gekarakteriseerd. , en kan verschillen tussen verschillende families van Nidovirales-doeleinden.Op dezelfde manier moeten de relevante doelwitten van andere geneste virussen nog worden bepaald.Het kunnen afgelegen orthologen van nsp9 of andere eiwitten zijn, omdat de sequenties buiten de vijf replicasedomeinen die over het algemeen geconserveerd zijn in geneste virussen minder geconserveerd zijn (8), inclusief de genoomarray tussen Mpro en NiRAN. Onder hen bevindt nsp9 zich in de coronavirus.
Bovendien kunnen we momenteel de mogelijkheid niet uitsluiten dat het NiRAN-domein aanvullende (inclusief mobiele) doelen heeft.In dit geval is het vermeldenswaard dat de bacteriële homologen in dit opkomende eiwit NMPylators (NMPylators) (30, 31) “masterregulators” lijken te hebben?NMP moduleert een verscheidenheid aan cellulaire eiwitten om hun stroomafwaartse activiteiten te reguleren of te elimineren, waardoor ze een rol spelen in een verscheidenheid aan biologische processen, zoals cellulaire stressrespons en redoxhomeostase (22, 33).
In deze studie (figuren 2 en 4 en SI-bijlage, figuren S3 en S5) konden we bewijzen dat nsp12 het UMP (NMP)-gedeelte naar een enkele (geconserveerde) positie in nsp9 overbracht, terwijl andere eiwitten niet werden gemodificeerd in de gebruikt Onder de omstandigheden wordt een goed gedefinieerde (in plaats van losse) substraatspecificiteit ondersteund.In overeenstemming hiermee is, vergeleken met N-terminale nsp9-NMPylatie, de eigen NMPylatie-activiteit van nsp12 erg laag, vereist de detectie ervan een langere blootstellingstijd aan autoradiografie en wordt een tienvoudige toename van de nsp12-concentratie gebruikt.Bovendien slaagde onze MS-analyse er niet in bewijs te leveren voor NMPylatie van nsp12, wat suggereert dat zelf-NMPylatie in het NiRAN-domein (op zijn best) een secundaire activiteit is.Er moet echter worden opgemerkt dat andere onderzoeken voorlopig bewijs hebben geleverd dat de zelf-AMPylatiestatus van bacteriële NMPylator hun NMPylatie-activiteit op andere eiwitsubstraten kan controleren (22, 33).Daarom is er meer onderzoek nodig om de mogelijke functionele effecten van zelf-NMPyleringsactiviteiten gerapporteerd voor EAV nsp9 (16) en coronavirus nsp12 (deze studie) te onderzoeken, inclusief het voorgestelde chaperonne-achtige effect op de vouwing van het C-terminale RdRp-domein ( 16) ).
Eerder zijn verschillende hypothesen met betrekking tot de mogelijke stroomafwaartse functies van het nidovirale NiRAN-domein overwogen, waaronder RNA-ligase, RNA-capped guanylaattransferase en eiwitpriming-activiteit (16), maar geen daarvan is compatibel met de beschikbare stroomafwaartse functies.De informatie verkregen in de volgende posities is exact hetzelfde tijdstip zonder aanvullende aannames te doen.De in dit onderzoek verkregen gegevens komen het meest overeen met (maar kunnen niet bewijzen) dat het NiRAN-domein betrokken is bij de initiatie van door eiwit geïnduceerde RNA-synthese.Vroeger werd aangenomen dat de functie van het NiRAN-domein in 5??²-RNA-capping- of RNA-ligatiereacties worden niet beïnvloed door deze en ondersteuning van andere gegevens.Daarom wordt er bijvoorbeeld van uitgegaan dat de actieve plaats van NiRAN de geconserveerde Asp als algemene basis omvat (D252 in Pseudomonas syringae SelO; D4271 in HCoV-229E pp1ab; D208 in SARS-CoV-2 nsp12) (SI-bijlage, figuur 2 ).S2) (17, 22, 33), terwijl de katalyse in het ATP-afhankelijke RNA-ligase en RNA-capping-enzym wordt uitgevoerd door het covalente enzym-(lysyl-N)-NMP-tussenproduct, waarbij een niet-veranderd Lys-residu betrokken is ( 41).Bovendien is de opmerkelijke sequentiegebaseerde specificiteit van het coronavirus NiRAN voor geconserveerde eiwitdoelen en de ontspannen specificiteit voor NTP-co-substraten (bij voorkeur UTP) in strijd met NiRAN-gemedieerde capping-enzym- of RNA-ligase-achtige functies.
Het is duidelijk dat er veel extra werk nodig is om de mogelijke rol van nsp9-UMP (nsp9-NMP) in eiwitgeïnduceerde RNA-synthese te verifiëren en, indien bewezen, uit te werken, wat verschillende interessante, maar (tot nu toe) eerder gerapporteerde rapporten zal verbinden .Geïsoleerde observaties.Er is bijvoorbeeld vastgesteld dat het uiteinde van het negatiefstrengige RNA van het coronavirus begint met een oligo(U)-streng (42, 43).Deze waarneming komt overeen met het idee dat de synthese van RNA met een negatieve streng wordt geïnitieerd door binding van de UMPylated vorm van nsp9 aan de poly(A)-staart (triggers), wat kan worden bevorderd door zijn RNA-binding. De activiteit en/of interactie met een ander RTC-eiwit.Het door nsp9 geleverde UMP-gedeelte kan vervolgens worden gebruikt als een “primer” voor door nsp7/8/nsp12 gemedieerde oligouridylering, met behulp van de 3??²-poly(A)-staart in het genomische RNA of een andere oligo (A)-bevattende sequentie dient als matrijs, vergelijkbaar met het mechanisme dat is vastgesteld voor het picornavirus VPg-eiwit (44).Wat als het voorstel ‘niet-normatief’ is????De start van de (eiwit-geïnduceerde) synthese van negatief streng-RNA levert een link op naar de waarnemingen, wat erop wijst dat het negatief-streng-RNA van het coronavirus aan het uiteinde UMP (in plaats van UTP) heeft (42), wat erop wijst dat de nucleïnezuur Dicer splitst het uiteinde gefosforyleerd door een onbekend uridine-specifiek endonuclease.Indien bevestigd, kan deze hydrolytische activiteit van nucleïnezuren helpen de oligomere UMPylated vorm van nsp9 vrij te maken van het 5²-uiteinde van de ontluikende negatieve streng.De mogelijke rol van nsp9 bij het primen van eiwitten komt ook overeen met eerdere reverse genetica-onderzoeken, die hebben aangetoond dat nsp9 (en nsp8) kritisch en specifiek interageren met het geconserveerde cis-werkende RNA-element nabij het derde uiteinde van het coronavirusgenoom.45).Volgens dit rapport kunnen deze eerdere observaties nu opnieuw worden onderzocht en uitgebreid door verder onderzoek.
Samenvattend bepaalden onze gegevens de specifieke activiteit van een gepatenteerde geneste virusenzymtag gekoppeld aan RdRp aan de N-terminus.Bij het coronavirus wordt deze nieuw ontdekte NiRAN-gemedieerde UMPylator/NMPylator-activiteit gebruikt om te vertrouwen op Mn2+ en aangrenzende Asn-residuen en de vorming van (laagenergetische) fosforamidaatbindingen met het N-terminale primaire amine te veroorzaken.Via Mpro-gemedieerde splitsing op de nsp8|9-splitsingsplaats kan het nsp9-doelwit worden gebruikt voor NMPylatie, wat de functionele koppeling tussen het protease en het NiRAN-domein aangeeft, die zich uitstrekt tot RdRp.Het behoud van belangrijke residuen in de actieve site van nsp12 NiRAN en het nsp9-doelwit, gecombineerd met gegevens verkregen van twee coronavirussen, waaronder SARS-CoV-2, levert sterk bewijs dat nsp9-NMPylatie een coronavirus is. Conservatieve kenmerken zijn ook een belangrijke stap in de virusreplicatie.De beschikbare gegevens leiden ons tot de conclusie dat de specifieke rol van NMPylated vorm van nsp9 in eiwit-geïnduceerde RNA-synthese een redelijk scenario is voor coronavirus en andere geneste virussen, en dat NiRAN zich mogelijk ook op andere niet-geïdentificeerde eiwitten richt.Reguleer het virus.Interactie met gastheer.Indien bevestigd zal de betrokkenheid van eiwitprimers bij de synthese van viraal RNA de sequentieaffiniteit van de Mpro/3CLpro- en RdRp-domeinen tussen de eerder gedetecteerde coronavirus- en picornavirus-achtige supergroep verhogen (9), die nu verenigd zijn in de recentelijk opgerichte Pisonivirieten (9). 46) in de categorie.
Onze gegevens laten ook zien dat de fundamentele, selectieve en conservatieve enzymactiviteiten die in dit onderzoek zijn geïdentificeerd, kunnen worden gebruikt als doelwitten voor antivirale geneesmiddelen.Verbindingen die de binding (en daaropvolgende modificatie) van het geconserveerde nsp9 N-uiteinde in de actieve plaats van NiRAN verstoren, kunnen worden ontwikkeld tot effectieve en veelzijdige antivirale geneesmiddelen, geschikt voor de behandeling van dierlijke en menselijke coronavirussen van verschillende (sub)genusinfecties , inclusief SARS-CoV-2 en het Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus.
De coderende sequentie van het coronaviruseiwit dat in dit onderzoek werd geproduceerd, werd geamplificeerd door RT-PCR met behulp van RNA geïsoleerd uit Huh-7 geïnfecteerd met HCoV-229E of Vero E6 geïnfecteerd met SARS-CoV-2, en ingevoegd met behulp van standaard kloonprocedures.pMAL-c2 (New England Biological Laboratory) of pASK3-Ub-CHis6 (47) expressievector (SI-bijlage, tabellen S1 en S2).Substituties van één codon werden geïntroduceerd door op PCR gebaseerde plaatsgerichte mutagenese (48).Om het MBP-fusie-eiwit te produceren, werden E. coli TB1-cellen getransformeerd met het geschikte pMAL-c2-plasmideconstruct (SI-bijlage, Tabel S1).Het fusie-eiwit werd gezuiverd door middel van amylose-affiniteitschromatografie en gesplitst met factor Xa.Vervolgens werd het C-terminale His6-gelabelde eiwit gezuiverd door Ni-geïmmobiliseerde metaalaffiniteitschromatografie (Ni-IMAC) zoals eerder beschreven (49).Om het ubiquitine-fusie-eiwit te produceren, gebruikten E. coli TB1-cellen het juiste pASK3-Ub-CHis6-plasmideconstruct (SI-bijlage, tabellen S1 en S2) en pCGI-plasmide-DNA dat codeert voor ubiquitine-specifieke C-terminale hydrolase 1 (Ubp1).Transformatie (47).Het C-terminale met His6 gemerkte coronaviruseiwit werd gezuiverd zoals eerder beschreven (50).
De zelf-NMPylatietest van HCoV-229E nsp12-His6 werd uitgevoerd zoals beschreven in EAV nsp9 (16).Kortom, nsp12-His6 (0,5 µM) bevat 50 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethaansulfonzuur (HEPES)-KOH, pH 8,0, 5 mM dithiothreitol (DTT), 6 mM MnCl2, 25 µM buffer, incubeer het gespecificeerde NTP en 0,17 µM kwamen overeen met [α32-P]NTP (3.000 Ci/mmol; Hartmann Analytic) bij 30 °C gedurende 30 minuten.In alle andere (standaard) NMPylatietesten van nsp12-gemedieerde nsp9 NMPylatie worden de reactieomstandigheden als volgt aangepast: nsp12-His6 (0,05 µM) en nsp9-His6 (4 µM) in aanwezigheid van 50 mM HEPES-KOH (pH 8,0). ), 5 mM DTT, 1 mM MnCl2, 25 µM duidden op NTP, en 0,17 µM kwam overeen met [a32-P]NTP.Na 10 minuten incuberen bij 30°C werd het reactiemonster gemengd met SDS-PAGE monsterbuffer: 62,5 mM tris(hydroxymethyl)aminomethaan HCl (pH 6,8), 100 mM DTT, 2,5% SDS, 10% glycerol en 0,005% broomfenol. blauw.Het eiwit werd gedenatureerd door 5 minuten verwarmen op 90°C en gescheiden door 12% SDS-PAGE.De gel wordt gefixeerd en gekleurd met Coomassie Brilliant Blue-oplossing (40% methanol, 10% azijnzuur, 0,05% Coomassie Brilliant Blue R-250), ontkleurd en gedurende 20 uur blootgesteld aan een fosforescerend beeldscherm (om nsp12 van NMPylatie te detecteren) of (maximaal) 2 uur (om nsp9 NMPylatie te beoordelen).Een Typhoon 9200-imager (GE Healthcare) werd gebruikt om het scherm te scannen en ImageJ werd gebruikt om de signaalintensiteit te analyseren.
Voor MS-analyse werden 1 µM nsp12-His6 en 10 µM nsp9 (zonder hexahistidine-tag) gebruikt in NMPyleringsanalyse (SI-bijlage, Tabel S1) en de verhoogde concentratie van 500 µM UTP en GTP werd gebruikt.Afhankelijk van hun concentratie en verwachte eiwitkwaliteit werd een Waters ACQUITY H-Klasse HPLC-systeem uitgerust met een MassPrep-kolom (Waters) gebruikt om 1 tot 10 µl gebufferde eiwitoplossingen online te ontzouten.Het ontzoute eiwit wordt geëlueerd in de elektrospray-ionenbron van de Synapt G2Si-massaspectrometer (Waters) via de volgende gradiënt van buffer A (water/0,05% mierenzuur) en buffer B (acetonitril/0,045% mierenzuur), en de kolomtemperatuur wordt 60 ° C en een stroomsnelheid van 0,1 ml/min: isocratisch elueren met 5% A gedurende 2 minuten, vervolgens een lineaire gradiënt naar 95% B binnen 8 minuten, en 95% B gedurende nog eens 4 minuten handhaven.
Positieve ionen met een massabereik van 500 tot 5000 m/z worden gedetecteerd.Glu-fibrinopeptide B wordt elke 45 seconden gemeten voor automatische massadriftcorrectie.Gebruik MassLynx-instrumentsoftware met MaxEnt1-extensie om het gemiddelde spectrum te deconvolueren na aftrek van de basislijn en afvlakking.
UMPylated HCoV-229E nsp9 werd gedigereerd door het toevoegen van gemodificeerde trypsine van sequencing-kwaliteit (Serva) en overnacht bij 37 ° C geïncubeerd.Een Chromabond C18WP-draaikolom (onderdeelnummer 730522; Macherey-Nagel) werd gebruikt om de peptiden te ontzouten en te concentreren.Tenslotte werd het peptide opgelost in 25 µl water, dat 5% acetonitril en 0,1% mierenzuur bevatte.
De monsters werden door MS geanalyseerd met behulp van een Orbitrap Velos Pro massaspectrometer (Thermo Scientific).Het ultieme nano HPLC systeem (Dionex), voorzien van een op maat gemonteerde 50 cm?75 μm C18 RP-kolom gevuld met magnetische kralen van 2,4 μm (Dr. Albin Maisch High Performance LC GmbH) Maak online verbinding met de massaspectrometer via de Proxeon-nanospraybron;injecteer 6 μL trypsine-digestieoplossing in een binnendiameter van 300 μm × ??1 cm C18 PepMap pre-concentratiekolom (Thermo Scientific).Met behulp van water/0,05% mierenzuur als oplosmiddel werd het monster automatisch opgevangen en ontzilt met een stroomsnelheid van 6 µl/min.
De volgende gradiënten van water/0,05% mierenzuur (oplosmiddel A) en 80% acetonitril/0,045% mierenzuur (oplosmiddel B) werden gebruikt om de scheiding van tryptische peptiden te bereiken bij een stroomsnelheid van 300 nL/min: 4% B voor 5 minuten, daarna 30 A lineaire gradiënt naar 45% B binnen minuten, en een lineaire stijging naar 95% oplosmiddel B binnen 5 minuten.Sluit de chromatografische kolom aan op een roestvrijstalen nano-emitter (Proxeon) en spuit het eluens rechtstreeks in het verwarmde capillair van de massaspectrometer met behulp van een potentiaal van 2.300 V. De onderzoeksscan met een resolutie van 60.000 in de Orbitrap-massa-analysator is geassocieerd met ten minste drie MS/MS-gegevensscans, dynamisch uitgesloten gedurende 30 seconden, met behulp van lineaire ionenvalbotsing-geïnduceerde dissociatie of botsingsdissociatie met hogere energie gecombineerd met orbittrap-detectie, is de resolutie 7.500.
Posttijd: 03-aug-2021